Los vesículos extracelulares (EVs) son vesículos membranosos que se encuentran en fluidos biológicos con funciones esenciales. Sin embargo, las proteínas de EV derivadas de la leche de vacas con mastitis clínica (CM) y mastitis subclínica (SM) aún no se han estudiado en detalle. En este estudio, se extrajeron EVs derivados de la leche de vacas con CM, SM y sanas utilizando una combinación de ácido acético/ultracentrifugación y ultracentrifugación en gradiente de densidad, y se analizaron mediante un proteómico de tipo shotgun en modo de adquisición independiente de datos. Se identificaron y cuantificaron un total de 1253 proteínas de exosomas de leche. Se identificaron proteínas diferencialmente enriquecidas (DE) con un ajuste de Benjamini-Hochberg < 0.05 y un cambio de pliegue de al menos 2. Hubo 53 y 1 proteínas DE en los EVs derivados de la leche de vacas con CM y SM en comparación con vacas sanas. La proteína S100-A9, la proteína S100-A8, la quitinasa-3-like proteína 1, la haptoglobina, la integrina beta-2 y la proteína de canal intracelular de cloruro 1 fueron más abundantes en el grupo de CM (ajustado < 0.05). Sin embargo, su enriquecimiento en el grupo de SM no fue significativo como en el grupo sano. El enriquecimiento de proteínas DE entre el grupo de CM y el grupo sano fue consistente con procesos GO (Gene Ontology) elevados-respuesta de defensa, respuesta de defensa a bacterias Gram-positivas, quimiotaxis de granulocitos, que también contribuyeron a las vías de Reactome-desgranulación de neutrófilos, sistema inmunológico innato y péptidos antimicrobianos en el grupo de CM. Estos resultados proporcionan información esencial sobre las proteínas asociadas a la mastitis en los EVs derivados de la leche e indican que las funciones biológicas de las proteínas de los EVs derivados de la leche requieren una mayor elucidación.