Las características bioquímicas recién descubiertas de la placenta pueden proporcionar nuevas perspectivas para estudios adicionales sobre los posibles marcadores de embarazo fisiológico/patológico o la función de la placenta. Comparamos el proteoma de la placenta de vaca lechera después de la hidrólisis enzimática por tres proteasas diferentes utilizando un enfoque de espectrometría de masas sin etiquetado. En total, se identificaron 541, 136 y 86 proteínas en el grupo de tripsina (TRY), el grupo de pepsina (PEP) y el grupo de papaína (PAP). Al comparar el proteoma de los grupos PAP y TRY, PEP y TRY, y PEP y PAP, se identificaron 432, 421 y 136 proteínas expresadas diferencialmente, respectivamente. Comparamos las DEP reguladas al alza y las DEP reguladas a la baja de cada grupo de comparación. Los resultados muestran que las proteínas identificadas por papaína provenían principalmente de la matriz extracelular y colágeno, y estaban enriquecidas en la vía de señalización de relaxina y la vía de señalización AGE-RAGE en complicaciones diabéticas; la digestión por pepsina pudo identificar más proteínas relacionadas con el músculo, que estaban enriquecidas en el lisosoma, activación de plaquetas, contracción del músculo cardíaco, invasión bacteriana de células epiteliales y cáncer de pulmón de células pequeñas; la tripsina degradó principalmente enzimáticamente la matriz extracelular, partículas sanguíneas y proteínas de superficie celular que estaban enriquecidas en el metabolismo de arginina y prolina, proteasoma de transducción olfativa, procesamiento de proteínas en el retículo endoplásmico, metabolismo de piruvato y miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho (ARVC). En resumen, estos resultados proporcionan perspectivas sobre el descubrimiento de las funciones fisiológicas de la placenta de vaca lechera y la selección de proteasas en la proteómica de la placenta de vaca lechera.