El encharcamiento es uno de los factores abióticos clave que impide severamente el crecimiento y la productividad de la soja a nivel global. Para desarrollar cultivares de soja que sean tolerantes al encharcamiento, es un requisito previo desentrañar los mecanismos que rigen las respuestas de la soja al encharcamiento. Por lo tanto, exploramos los cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y de expresión génica en dos líneas de introgressión de soja contrastantes, A192 (tolerante al encharcamiento, WT) y A186 (sensible al encharcamiento, WS), bajo encharcamiento. En comparación con la línea WT, el encharcamiento disminuyó drásticamente la longitud de la raíz (RL), la longitud del tallo (ShL), el peso fresco de la raíz (RFW), el peso fresco del tallo (ShFW), el peso seco de la raíz (RDW) y el peso seco del tallo (ShDW) de la línea WS. De manera similar, el encharcamiento inhibió el crecimiento de la planta de soja al suprimir la capacidad fotosintética de la planta, aumentar el daño oxidativo por especies reactivas de oxígeno y disminuir el contenido de clorofila en la línea WS, pero no en la línea WT. Para contrarrestar el daño oxidativo y la peroxidación lipídica, la línea WT mostró una mayor actividad de enzimas antioxidantes como la peroxidasa (POD), la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT), así como niveles más altos de contenido de prolina que la línea WS. Además, se encontró que la expresión de los genes de enzimas antioxidantes y los genes relacionados con el etileno se regulaban al alza en la línea WT bajo condiciones de estrés por encharcamiento. En contraste, estos genes mostraron una regulación a la baja en sus niveles de expresión en la línea WS estresada. La integración de análisis morfo-fisiológicos, bioquímicos y de expresión génica proporciona una comprensión integral de las respuestas de las líneas WT y WS a las condiciones de encharcamiento. Estos hallazgos serían beneficiosos para el desarrollo futuro de cultivares de soja que puedan resistir el encharcamiento.