El estrés por calor constituye una gran amenaza para la producción de cultivos, y según las proyecciones climáticas, se espera que las temperaturas nocturnas aumenten más rápido y en mayor medida en comparación con las temperaturas diurnas. Aunque se ha dedicado una extensa investigación a los efectos de temperaturas diurnas superiores a lo óptimo en la fisiología, metabolismo y rendimiento del algodón, y aunque se han introducido cultivares de algodón tolerantes al calor, las respuestas de tales cultivares tolerantes al calor a temperaturas nocturnas altas no han sido evaluadas. El objetivo de este estudio fue evaluar la eficiencia de los cultivares tolerantes al calor frente al estrés por altas temperaturas nocturnas mediante el monitoreo de las respuestas fisiológicas y bioquímicas de dos cultivares de algodón, diferentes en termotolerancia, sometidos a temperaturas nocturnas superiores a lo óptimo, durante la antesis. Para ello, se realizaron experimentos en cámaras de crecimiento utilizando dos cultivares de algodón diferentes en termotolerancia, a saber, ST5288B2RF (termosensible) y VH260 (termotolerante). Los tratamientos consistieron en temperaturas normales de día/noche (32/24 grados Celsius) y altas temperaturas nocturnas (32/30 grados Celsius) durante 2 semanas en floración (aproximadamente 8 semanas después de la siembra). Los resultados indicaron que VH260 fue más termotolerante que ST5288 incluso bajo condiciones de estrés por alta temperatura nocturna, ya que logró mantener sus tasas netas de fotosíntesis, la integridad de la membrana celular, así como los contenidos de carbohidratos del pistilo y finalmente logró un mayor peso reproductivo total. Se concluyó que la tolerancia al calor de los cultivares termotolerantes seleccionados bajo condiciones de altas temperaturas diurnas también se conserva bajo altas temperaturas nocturnas, mientras que las tasas netas de fotosíntesis y la integridad de la membrana celular pueden ser utilizadas como rasgos de selección para la tolerancia al calor bajo altas temperaturas diurnas o nocturnas.