Este estudio investigó la motilidad y fertilidad del semen congelado y descongelado de toros Pantaneiros, comparando muestras recolectadas a través de la eyaculación y directamente del epidídimo. El objetivo era evaluar el potencial del semen epididimal para su uso en programas de conservación mediante la evaluación de su motilidad post-descongelación y fertilidad in vitro. Se analizó el semen de cinco toros para determinar la calidad fresca, los niveles de ADN libre de células (cfDNA) y el rendimiento de los espermatozoides después de la congelación. Los resultados mostraron que el semen epididimal tenía menos defectos y exhibía una motilidad superior después de la descongelación en comparación con el semen eyaculado. A pesar de estas diferencias, ambas fuentes de semen fueron igualmente efectivas para fertilizar ovocitos in vitro. La caracterización de los niveles de cfDNA aporta valiosos conocimientos al campo de la fertilidad masculina y apoya los esfuerzos para conservar razas de ganado indígena. Esta investigación contribuye a mejorar las técnicas de preservación de semen y destaca la motilidad del semen epididimal como un recurso reproductivo en la cría de ganado y estrategias de conservación.