La variación epigenética en la regeneración de protoplastos es un tema que ha atraído interés recientemente. Para elucidar el papel de la metilación del ADN en la regeneración de protoplastos de ponkan, este estudio emplea la técnica de marcadores moleculares de polimorfismo de amplificación sensible a la metilación (MSAP) para analizar los cambios en los niveles y patrones de metilación del ADN durante la aislamiento y cultivo de protoplastos de ponkan y tabaco. Además, se clonan, secuencian y someten a análisis bioinformáticos fragmentos de ADN metilados diferencialmente. Los resultados revelan que, para los protoplastos de mesófilo de ponkan no regenerables, los niveles de metilación del ADN aumentan en un 3.98% después de la aislamiento y luego muestran una tendencia de disminución inicial seguida de un aumento durante el cultivo. En contraste, para los protoplastos de callo de ponkan regenerables y los protoplastos de mesófilo de tabaco, los niveles de metilación del ADN disminuyen en un 1.75% y un 2.33%, respectivamente, después de la aislamiento. Durante el cultivo, los niveles de metilación del ADN de los protoplastos de callo de ponkan primero aumentan y luego disminuyen, mientras que los de los protoplastos de mesófilo de tabaco muestran una tendencia opuesta de disminución inicial seguida de un aumento. En cuanto a los patrones de metilación del ADN, los protoplastos de mesófilo de ponkan exhiben principalmente cambios de hipermetilación acompañados de una pequeña cantidad de desmetilación génica, mientras que los protoplastos de callo de ponkan están dominados por cambios de desmetilación con algunos genes experimentando hipermetilación. La metilación exhibe cambios dinámicos en la regeneración de aislamiento de protoplastos. Al recuperar, clonar, secuenciar y realizar un análisis de alineación BLASTn en sitios específicos de modificación de metilación en el ponkan, se identifican 18 secuencias de ADN con alta homología que se encuentran involucradas en diversas funciones biológicas, estableciendo así una base fundamental para la edición genética en protoplastos.