En este estudio in vitro, nuestro objetivo fue evaluar y comparar la eficacia antibacteriana de una nueva modalidad láser de granate de aluminio dopado con erbio, la emisión mejorada de ondas de choque de streaming fotoacústico (SWEEPS), irrigación activada por ultrasonido (UAI) e irrigación con aguja única (SNI) contra un biofilm bacteriano antiguo. Un biofilm de dos semanas de antigüedad fue cultivado en discos dentinarios transversales hechos del tercio medio de las raíces de premolares de un solo canal y una sola raíz. El crecimiento del biofilm fue confirmado utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía confocal láser (CLSM). Las muestras de dentina fueron distribuidas aleatoriamente en tres grupos experimentales y un grupo control basado en el protocolo de irrigación utilizado: Grupo 1, SWEEPS; Grupo 2, UAI; y Grupo 3, SNI. Los conductos radiculares fueron irrigados con una solución de hipoclorito de sodio al 3%. La eficacia antibacteriana fue evaluada cuantitativamente a través de cultivos bacterianos y cualitativamente a través de CLSM y SEM. Tanto SWEEPS como UAI demostraron una reducción estadísticamente significativa en las unidades formadoras de colonias (UFC) (<0.001), mientras que SNI no mostró una reducción estadísticamente significativa (=0.553). No se observó diferencia significativa entre la eficacia de SWEEPS y UAI (>0.05). Las técnicas de SWEEPS y UAI fueron igualmente efectivas en la eliminación de biofilm maduro.