Los avances recientes en tecnologías genómicas han permitido un estudio más profundo del microbioma oral. En este estudio, comparamos los amplicones generados por cebadores que apuntan a diferentes sitios del gen 16S rRNA encontrados en la Base de Datos del Microbioma Oral Humano (HOMD). Se probaron seis juegos de cebadores que apuntaban a las regiones V1-V2, V1-V3, V3-V4, V4-V5, V5-V7 y V6-V8 del gen 16S rRNA mediante simulación in silico. Los cebadores que apuntaban a las regiones V1-V2, V3-V4 y V4-V5 generaron más del 90% de las secuencias de entrada originales. Los cebadores que apuntaban a las regiones V1-V2 y V1-V3 mostraron un bajo número de desajustes y secuencias no clasificadas a nivel taxonómico, pero hubo discrepancias notables a nivel de especie. Las comparaciones de árboles filogenéticos mostraron que los cebadores que apuntaban a las regiones V1-V2 y V3-V4 tenían un rendimiento similar a los cebadores que apuntaban a toda la región del 16S rRNA en términos de separar microbiomas orales totales y periodontopatógenos. En un análisis de muestras clínicas orales, los cebadores V1-V2 mostraron un rendimiento superior para identificar más taxones y una mejor sensibilidad de resolución que los cebadores V3-V4. En conclusión, los cebadores que apuntan a la región V1-V2 del 16S rRNA mostraron el mejor rendimiento para estudios del microbioma oral. Además, el estudio demuestra la necesidad de una cuidadosa selección de cebadores de PCR.