El género Oligoryzomys incluye especies de pequeño tamaño, morfológicamente similares, lo que puede dificultar la identificación taxonómica, principalmente entre O. flavescens (Waterhouse, 1837) y O. nigripes (Olfers, 1818). El objetivo principal de este trabajo fue investigar si los marcadores RAPD son capaces de diferenciar genéticamente los especímenes de O. nigripes y O. flavescens, provenientes de los estados de Rio Grande do Sul (RS) y Santa Catarina (SC), y también estimar la variabilidad genética entre las poblaciones de O. nigripes, con el río Uruguay como barrera geográfica. Para ello, se recolectaron muestras en fragmentos de bosque situados en el norte de RS, en FLONA (Floresta Nacional de Passo Fundo) y en fragmentos de SC, cerca del río Uruguay. Se realizó el cariotipado de dos muestras de cada especie y se comparó mediante la técnica RAPD con individuos no cariotipados. Las muestras de O. nigripes presentaron 2n = 62; NA = 82, con brazos submetacéntricos en los cromosomas más grandes, mientras que las muestras de O. flavescens mostraron 2n = 64; NA = 66, con los cromosomas más grandes presentando morfología acrocéntrica, lo que convierte a este resultado en la principal diferencia entre las especies. El análisis permitió detectar dos grupos distintos: el primero con O. flavescens cariotipado y el segundo con O. nigripes cariotipado. La identificación arrojó 211 loci, de los cuales 181 (85,78%) polimórficos. El coeficiente de similitud de Jaccard se ubicó entre 0,45 y 0,87. Las técnicas UPGMA y de Análisis de Coordenadas Principales demostraron la existencia de genética heterogénea entre las poblaciones, pero no las separaron completamente en términos de estándares geográficos, y no están influenciadas por el río Uruguay, que no actuó como una barrera eficaz.