Comparabilidad de los métodos de extracción de ADN de CMV y validación de la carga viral
Autores: Uwiringiyeyezu, Théophile; El Khalfi, Bouchra; Saile, Rachid; Belhachmi, Jamal; Soukri, Abdelaziz
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2022
Acceso abierto
Artículo científico
2022
Comparabilidad de los métodos de extracción de ADN de CMV y validación de la carga viral
Categoría
Ingeniería y Tecnología
Subcategoría
Bioingeniería
Palabras clave
Citomegalovirus
Infección
Extracción de ADN
Amplificación por PCR
Pacientes trasplantados
Protocolos
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 42
Citaciones: Sin citaciones
El citomegalovirus humano es un herpesvirus que tiene una seroprevalencia mundial de más del 60% en adultos en países desarrollados y del 90% en países en desarrollo. Las discapacidades graves en recién nacidos son características de la infección congénita por citomegalovirus humano, y este virus está implicado en el rechazo de injertos en pacientes trasplantados. Para tratar y dar seguimiento a la infección, se requieren cargas virales de CMVPCR, y el paso de extracción de ADN sigue siendo muy importante; sin embargo, la cantidad, calidad y pureza del ADN extraído de diferentes fluidos biológicos influyen en los resultados de la amplificación por PCR, por lo que para obtener resultados confiables, la elección de los métodos de extracción de ácidos nucleicos requiere una atención cuidadosa. En este estudio, comparamos 4 protocolos, I (kit de virus EZ1 DSP), II (kit mini de virus EZ1), III (kit de virus QIAamp DSP) y IV (calentamiento); las extracciones se realizan a partir de plasma recolectado en tubos de EDTA, y la concentración de ADN extraído se mide en NanoDrop Lite seguido de CMVPCR en tiempo real utilizando un kit Artus CMV QS-RGQ. Todos los protocolos se realizan siguiendo las instrucciones del fabricante. Este estudio se realiza en las muestras de 135 pacientes trasplantados cuyas pruebas médicas de seguimiento están relacionadas con la infección por citomegalovirus humano; dado que la mayoría de los resultados de CMVPCR son negativos, hemos elegido las 10 muestras positivas de CMVPCR y 2 muestras negativas como controles para llevar a cabo este estudio comparativo. Al evaluar la concentración de ADN con NanoDrop Lite, el rendimiento de ADN extraído es mayor en nuestro protocolo de calentamiento que en los otros protocolos, el kit de virus EZ1 DSP y el kit mini de virus EZ1 muestran cantidades homogéneas, y el kit de virus QIAamp DSP muestra rendimientos de ADN muy bajos. Al comparar el umbral de ciclo y las cargas virales mediante PCR en tiempo real, todos estos protocolos identificaron muestras negativas (100%), y las muestras previamente positivas utilizadas fueron las siguientes: protocolo IV (90%), protocolo II (60%) y protocolo I (40%). Los resultados del kit de virus QIAamp DSP no fueron aplicables a la PCR en tiempo real y no fueron concluyentes debido a los bajos rendimientos de ADN. Nuestro método de calentamiento desarrollado (protocolo IV) es muy efectivo, confiable, simple, rápido y económico en comparación con los otros protocolos en nuestro estudio.
Descripción
El citomegalovirus humano es un herpesvirus que tiene una seroprevalencia mundial de más del 60% en adultos en países desarrollados y del 90% en países en desarrollo. Las discapacidades graves en recién nacidos son características de la infección congénita por citomegalovirus humano, y este virus está implicado en el rechazo de injertos en pacientes trasplantados. Para tratar y dar seguimiento a la infección, se requieren cargas virales de CMVPCR, y el paso de extracción de ADN sigue siendo muy importante; sin embargo, la cantidad, calidad y pureza del ADN extraído de diferentes fluidos biológicos influyen en los resultados de la amplificación por PCR, por lo que para obtener resultados confiables, la elección de los métodos de extracción de ácidos nucleicos requiere una atención cuidadosa. En este estudio, comparamos 4 protocolos, I (kit de virus EZ1 DSP), II (kit mini de virus EZ1), III (kit de virus QIAamp DSP) y IV (calentamiento); las extracciones se realizan a partir de plasma recolectado en tubos de EDTA, y la concentración de ADN extraído se mide en NanoDrop Lite seguido de CMVPCR en tiempo real utilizando un kit Artus CMV QS-RGQ. Todos los protocolos se realizan siguiendo las instrucciones del fabricante. Este estudio se realiza en las muestras de 135 pacientes trasplantados cuyas pruebas médicas de seguimiento están relacionadas con la infección por citomegalovirus humano; dado que la mayoría de los resultados de CMVPCR son negativos, hemos elegido las 10 muestras positivas de CMVPCR y 2 muestras negativas como controles para llevar a cabo este estudio comparativo. Al evaluar la concentración de ADN con NanoDrop Lite, el rendimiento de ADN extraído es mayor en nuestro protocolo de calentamiento que en los otros protocolos, el kit de virus EZ1 DSP y el kit mini de virus EZ1 muestran cantidades homogéneas, y el kit de virus QIAamp DSP muestra rendimientos de ADN muy bajos. Al comparar el umbral de ciclo y las cargas virales mediante PCR en tiempo real, todos estos protocolos identificaron muestras negativas (100%), y las muestras previamente positivas utilizadas fueron las siguientes: protocolo IV (90%), protocolo II (60%) y protocolo I (40%). Los resultados del kit de virus QIAamp DSP no fueron aplicables a la PCR en tiempo real y no fueron concluyentes debido a los bajos rendimientos de ADN. Nuestro método de calentamiento desarrollado (protocolo IV) es muy efectivo, confiable, simple, rápido y económico en comparación con los otros protocolos en nuestro estudio.