La hipoxia en las células epiteliales de la glándula mamaria de búfalos lecheros (BMECs) puede afectar la producción y composición de la leche, e incluso puede causar enfermedades metabólicas. El cloruro de nitidina (NC) es un alcaloide natural con propiedades antioxidantes que puede eliminar especies reactivas de oxígeno (ROS) en exceso. Sin embargo, el efecto del NC sobre la lesión hipóxica de los BMECs y sus mecanismos moleculares aún se desconocen. Aquí, se utilizó un ensayo de inmunofluorescencia, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y citometría de flujo, combinados con metabolómica no dirigida, para investigar el efecto protector del NC sobre la lesión por estrés hipóxico en los BMECs. Se encontró que el NC puede reducir significativamente la actividad celular (< 0.05) e inhibir el estrés oxidativo celular (< 0.05) y la apoptosis celular (< 0.05). Se observó una disminución significativa en la mitofagia mediada por la vía PINK1-Parkin después del pretratamiento con NC (< 0.05). Además, un análisis de enriquecimiento de vías metabólicas demostró que los mecanismos del NC contra el estrés hipóxico pueden estar relacionados con la regulación a la baja de vías que involucran la biosíntesis de aminoacil tRNA; el metabolismo de arginina y prolina; el metabolismo de glicina, serina y treonina; la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano; y el metabolismo de fenilalanina. Así, el NC tiene un efecto protector sobre las mitocondrias hipóxicas y puede regular el metabolismo de aminoácidos en respuesta al estrés hipóxico. El presente estudio proporciona una referencia para la aplicación del cloruro de nitidina para regular la función de lactación mamaria de los búfalos lecheros.