Las enfermedades del tronco de la vid (ETVs) impactan la sostenibilidad de los viñedos en todo el mundo y las opciones de manejo son actualmente limitadas. Los agentes de control biológico (ACBs) pueden ofrecer una alternativa viable para el control de enfermedades. Con el objetivo de desarrollar una estrategia de biocontrol efectiva contra el patógeno de ETV, este estudio investigó lo siguiente: (1) la eficacia de las cepas en suprimir el patógeno de BD en cañas desprendidas y vides en macetas; (2) la capacidad de una cepa de ACB17 para colonizar y persistir en los tejidos de la vid; y (3) el modo de acción de ACB17 para antagonizar. Las co-inoculaciones de las cepas bacterianas antagonistas revelaron que una cepa de ACB17 suprimió la infección en un 100% y un 80% en cañas desprendidas y vides en macetas, respectivamente. Las inoculaciones en tallos de una cepa resistente a la rifampicina generada en laboratorio de ACB17 en vides en macetas (cv. Shiraz) indicaron que la cepa bacteriana podría colonizar y persistir en los tejidos de la vid, proporcionando potencialmente alguna protección contra las ETVs durante hasta 6 meses. Los compuestos bioactivos difusibles secretados por ACB17 redujeron significativamente la germinación de esporas y la biomasa fúngica de los otros patógenos representativos de ETV. Un análisis complementario a través de MALDI-TOF reveló la presencia de un lipopeptido cíclico desconocido en los compuestos bioactivos difusibles, que estaba ausente en una cepa no antagonista (JMN13), sugiriendo que este nuevo lipopeptido puede ser responsable de la actividad de biocontrol de ACB17. Nuestro estudio proporcionó evidencia de que ACB17 es un ACB potencial para combatir ETV, con un posible nuevo modo de acción.