El papel del saco vitelino (SV) en el aborto espontáneo aún no está claro, en gran parte debido a razones éticas que dificultan la realización de estudios in vivo. Sin embargo, las culturas en 3D podrían proporcionar una solución a este problema al permitir que las células se organicen de una manera que imite más de cerca la estructura del SV tal como existe in vivo. En este estudio, se eligieron tres especies domésticas (porcina, canina y bovina) como modelos para estandarizar técnicas de cultivo en 3D para el SV. Se eligieron dos técnicas de cultivo en 3D: las técnicas de Matrigel y de Goteo Colgante, y se utilizó la técnica de cultivo en 2D como método estandarizado. Las estructuras formadas se caracterizaron inicialmente utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM), inmunohistoquímica (IHC) y PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). En general, las muestras de cultivo en 3D mostraron una mejor organización de las células del SV en comparación con los cultivos en 2D. Las estructuras formadas por ambos métodos en 3D ensamblan la capa mesotelial del tejido del SV. En cuanto al ensayo de IHC, todos los modelos in vitro pudieron expresar marcadores de transporte de zinc y colesterol, aunque solo las técnicas de cultivo en 3D pudieron generar estructuras con diferentes patrones de marcadores, indicando un proceso de diferenciación celular en comparación con los cultivos en 2D. En cuanto a la expresión de ARNm, los modelos en 3D presentaron un mayor patrón de expresión génica en el gen relacionado con el tejido del SV, aunque no se encontró una expresión significativa en la alfa-fetoproteína, lo que indica una falta de diferenciación endodérmica en nuestro modelo en 3D. Con la técnica inicial y la caracterización establecidas, el siguiente paso es mantener los cultivos y caracterizar la diversidad de poblaciones celulares, la capacidad de stemness, las funciones y la estabilidad genética de cada modelo in vitro en 3D.