La leishmaniasis se está propagando en Europa, especialmente en países endémicos como Italia y España, en parte debido al cambio climático en curso y al aumento de los viajes y la migración. Aunque es el principal agente responsable de esta enfermedad en humanos y animales, se han detectado otras especies e híbridos. Esto resalta la necesidad de continuar aislando y caracterizando cepas de muestras biológicas de hospedadores infectados. En este estudio, caracterizamos los parásitos recientemente aislados NAV y TDL, obtenidos de mamíferos naturalmente infectados (perros), y los comparamos con la cepa ampliamente distribuida y estudiada BCN 150. Tanto los promastigotes NAV como TDL mostraron una tasa de crecimiento más lenta que BCN 150 y fueron significativamente más sensibles a la anfotericina B y a la miltefosina. Además, la expresión del gen (involucrado en el ciclo celular y la proliferación) se reguló a la baja de manera significativa en los aislados NAV y TDL. Por otro lado, los niveles de (implicados en la resistencia al tratamiento) y (relacionados con el reciclaje de proteínas en condiciones de estrés y/o durante un proceso de diferenciación y resistencia al tratamiento) se regularon al alza, en comparación con los medidos en BCN 150. Ambos aislados mostraron una mayor capacidad de infección (>3 amastigotes por macrófago y >70% de macrófagos infectados) en comparación con los controles.