La generación in vitro de uniones neuromusculares funcionales (NMJs) utilizando la misma fuente de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para músculo y motoneuronas sería de gran valor para la modelización de enfermedades y la ingeniería de tejidos. Aunque la diferenciación y caracterización de motoneuronas derivadas de iPSC están bien establecidas, y se ha informado sobre músculo esquelético derivado de iPSC (iPSC-SKM), hay una falta general de caracterización sistemática y funcional del iPSC-SKM. Este estudio realizó una caracterización sistemática de iPSC-SKM diferenciado utilizando un protocolo dirigido por moléculas pequeñas y libre de suero. Morfológicamente, el iPSC-SKM demostró la expresión y distribución apropiada de receptores de acetilcolina, rianodina y dihidropiridina. El análisis del tipo de fibra reveló una mezcla de tipos de músculo humano rápido (Tipo IIX, IIA) y lento (Tipo I) y la ausencia de fibras de tipo IIB animal. Funcionalmente, los iPSC-SKM se contrajeron de manera sincrónica al ser estimulados eléctricamente, con una fuerza de contracción comparable a la de los miofibras derivados de mioblastos primarios. Lo más importante es que, cuando se cocultivaron con motoneuronas derivadas de iPSC humanas de la misma fuente de iPSC, los miofibras se contrajeron en respuesta a la estimulación de las motoneuronas indicando la formación de NMJs funcionales. Al demostrar una capacidad estructural y funcional comparable a la de los miofibras derivados de mioblastos primarios, este sistema definido de iPSC-SKM, así como el sistema NMJ personal, tienen aplicaciones para pruebas de medicamentos específicas para pacientes e investigación de la fisiología y enfermedades musculares.