El conocimiento de la actividad enzimática específica, junto con los hábitos y la capacidad digestiva del animal, es esencial para formular una dieta adecuada para cualquier especie. En este estudio, evaluamos y caracterizamos la actividad de las enzimas digestivas presentes en el hígado, intestino y estómago de Paralichthys orbignyanus. También se evaluaron los efectos del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática mediante el uso de sustratos específicos. El uso de sustratos e inhibidores específicos mostró una fuerte evidencia de la presencia de tripsina (BApNA = 0,51 ± 0,2 mU mg-1), quimotripsina (SApNA = 2,62 ± 1,8 mU mg-1) y aminopeptidasas (Leu-p-Nan = 0,9709 ± 0,83 mU mg-1) en el intestino. El pH óptimo para la actividad de la tripsina, la quimiotripsina, la leucino aminopeptidasa, la amilasa y la pepsina fue de 9,5, 9,0, 8,0, 7,5 y 3,5, respectivamente, mientras que las temperaturas óptimas fueron de 50, 50, 50, 40 y 45 °C, respectivamente. Estos resultados proporcionan información adicional sobre la biología del lenguado brasileño y pueden servir de base para futuros estudios sobre la fisiología alimentaria de los peces.