El rendimiento de las vacas lecheras está estrechamente relacionado con el estado metabólico, y este rendimiento varía dependiendo del número de veces que las vacas han dado a luz. Sin embargo, todavía hay una falta de investigación sobre la relación entre el estado metabólico de las vacas Holstein y el rendimiento de la lactancia a través de múltiples partos. En este estudio, se realizaron análisis bioquímicos y estudios de metabolómica en el suero y la leche de vacas Holstein de partos 1-4 (H1, N = 10; H2, N = 7; H3, N = 9; H4, N = 9) en medio de la lactancia (DIM de 141 +/- 4 días) para investigar el vínculo entre el rendimiento y los cambios metabólicos. Los resultados del análisis de calidad de la leche mostraron que los niveles de lactosa eran más altos en H1 ( = 0.036). El contenido total de proteínas en el suero aumentó con el aumento del parto ( = 0.013). Además, se encontró que la actividad de lipasa era más baja en H1 ( = 0.022). No hubo diferencia en la composición de los aminoácidos hidrolizados en la leche entre H1 y H4. Sin embargo, los aminoácidos libres histidina y glutamato en el suero fueron más bajos en H1 y más altos en H3 ( < 0.001), mientras que la glicina fue más alta en H4 ( = 0.031). El análisis de metabolómica reveló que se identificaron 53 y 118 metabolitos diferenciales en la leche y el suero, respectivamente. Los metabolitos diferenciales en la leche de las vacas se clasificaron en siete categorías según KEGG. La mayoría de los metabolitos diferenciales en la leche de las vacas se encontraron en mayor abundancia en H1, y estos metabolitos se enriquecieron en dos vías de impacto. Los metabolitos diferenciales en el suero se pudieron clasificar en nueve categorías y se enriquecieron en seis vías metabólicas. Se identificaron un total de seis metabolitos compartidos en el suero y la leche, entre los cuales el colesterol y el ácido cítrico estaban estrechamente relacionados con el metabolismo de aminoácidos en el suero. Estos hallazgos indican una influencia significativa de los metabolitos sanguíneos en el metabolismo de energía y aminoácidos durante el proceso de producción de leche en las vacas Holstein a través de 1-4 lactancias, y que una comprensión profunda de los cambios metabólicos que ocurren en las vacas Holstein durante diferentes lactancias es esencial para la agricultura de precisión, y que vale la pena investigar más a fondo estos metabolitos clave que tienen un impacto a través de experimentos controlados.