Se ha establecido que el cultivo intercalado de maíz/soja puede mejorar la eficiencia en el uso del nitrógeno. Sin embargo, pocos estudios han abordado cómo el cultivo intercalado de maíz/soja afecta la diversidad de bacterias fijadoras de nitrógeno y la eficiencia de fijación de N de la soja intercalada. En este estudio, las comunidades de bacterias fijadoras de nitrógeno, la eficiencia de fijación de N y sus relaciones con las propiedades del suelo bajo tres tasas de aplicación de fertilización nitrogenada (N0 0 kg/ha, N1 40 kg/ha, N2 80 kg/ha) fueron exploradas a través de experimentos de campo. La fijación de nitrógeno y la diversidad de bacterias fijadoras de nitrógeno fueron evaluadas utilizando la abundancia natural de N, secuenciación de alto rendimiento de Illumina y cuantificación de copias de genes (de fijación de nitrógeno) en el suelo de la rizosfera de la soja intercalada. Los resultados mostraron que las tasas de aplicación de nitrógeno disminuyeron significativamente la diversidad de bacterias fijadoras de nitrógeno, la eficiencia de fijación de nitrógeno y las copias de genes en el suelo de la rizosfera. La eficiencia de fijación de nitrógeno, el número de nódulos y el peso seco de la soja intercalada fueron mayores en el tratamiento N0, y la fijación de nitrógeno fue mayor en el tratamiento N1. La eficiencia de fijación de nitrógeno en los tratamientos N0, N1 y N2 aumentó en un 69%, 59% y 42%, y el número de nódulos de soja fue del 10%, 22% y 21%, respectivamente, en comparación con los monocultivos. La diversidad de bacterias fijadoras de nitrógeno de la soja en el cultivo intercalado bajo los tratamientos N0 y N1 aumentó significativamente en comparación con los monocultivos. Hubo una correlación positiva significativa entre las copias de genes del suelo y la eficiencia de fijación de N y una correlación negativa con el nitrógeno disponible en el suelo. La abundancia de N en el suelo de la rizosfera de la soja disminuyó significativamente con el aumento de las tasas de aplicación de nitrógeno y se correlacionó significativamente con el contenido de AN (nitrógeno disponible) y pH en la rizosfera de la soja. Estos resultados nos ayudan a comprender los mecanismos mediante los cuales se mejoró la eficiencia en el uso del nitrógeno, y se podría reducir el uso de fertilizantes nitrogenados en el cultivo intercalado de leguminosas/gramíneas, lo cual es importante para mejorar la sostenibilidad de la producción agrícola.