Los ácidos grasos de cadena impar y ramificada (OBCFA) acumulados en productos de rumiantes son una clase de ácidos grasos beneficiosos para la salud humana. Dado que la biotina y la leucina están involucradas en la síntesis de OBCFA, este estudio tuvo como objetivo evaluar su efecto en la síntesis de OBCFA in vitro. Hubo cuatro tratamientos: el grupo de control que solo recibió la dieta basal, o la dieta basal suplementada con biotina (4 mg/kg de materia seca, MS), leucina (4 g/kg de MS), o una combinación de biotina (4 mg/kg de MS) y leucina (4 g/kg de MS). Los resultados mostraron que la biotina promovió la degradación de la MS (<0.10), mientras que la leucina aumentó significativamente la concentración de ácidos grasos volátiles de cadena ramificada y valerato (<0.05). Las concentraciones de ácidos grasos de cadena impar total, ácidos grasos totales, ácidos grasos de cadena ramificada total, OBCFA total y ácidos grasos totales aumentaron significativamente con la suplementación de biotina o leucina (<0.05). La biotina y la leucina estimularon significativamente las actividades de la acetil-CoA carboxilasa, la sintasa de ácidos grasos y la malonil-CoA, con un efecto de interacción significativo (<0.05). En conclusión, los resultados de este estudio sugieren que la biotina y la leucina pueden ser utilizadas como estrategias nutricionales efectivas para promover la síntesis de OBCFA.