(1) Antecedentes: La esterilidad masculina citoplasmática (CMS) es importante para aprovechar la heterosis. La soja (L.) tiene una baja tasa de cruzamiento que es perjudicial para la cría de líneas estériles y la producción de semillas híbridas. Por lo tanto, se debe elucidar el mecanismo molecular que controla la tasa de cruzamiento para aumentar la tasa de cruzamiento de las líneas CMS de soja; (2) Métodos: Se utilizaron las líneas de soja estéril JLCMS313A (con una alta tasa de cruzamiento; HL) y JLCMS226A (con una baja tasa de cruzamiento; LL) para un análisis combinado del transcriptoma (RNA-seq) y el metaboloma fenólico dirigido; (3) Resultados: La comparación entre HL y LL detectó 5946 genes expresados diferencialmente (DEGs) y 81 metabolitos fenólicos. El análisis de los DEGs y los metabolitos fenólicos diferencialmente abundantes identificó solo una vía KEGG común relacionada con la biosíntesis de flavonoides. La expresión de qRT-PCR para ocho DEGs fue casi consistente con los datos del transcriptoma. La comparación de las regiones de secuencia codificante (CDS) clonadas de los genes , , , y entre HL y LL reveló siete polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) solo en la CDS. Además, cinco metabolitos fenólicos diferencialmente abundantes significativos entre HL y LL se asociaron con vías metabólicas de flavonoides. Finalmente, sobre la base de los SNPs en la CDS, se desarrolló un marcador de secuencia polimórfica amplificada cortada derivada (dCAPS) para distinguir entre las líneas de soja HL y LL; (4) Conclusiones: La vía de biosíntesis de flavonoides puede afectar indirectamente la tasa de cruzamiento de las líneas estériles CMS en soja.