La predicción precisa de la hepatotoxicidad requiere modelos in vitro humanos validados que puedan cerrar la brecha entre los estudios preclínicos en animales y los ensayos clínicos. En este estudio investigamos la respuesta de células hepáticas humanas primarias a la exposición a fármacos tóxicos en un biorreactor hepático en 3D a escala microperfundida. Los biorreactores celularizados fueron tratados con 5, 10 o 30 mM de acetaminofén (APAP) utilizado como sustancia de referencia. La producción de lactato disminuyó significativamente al ser tratada con 30 mM de APAP ( < 0.05) y la liberación de amoníaco aumentó significativamente en los biorreactores tratados con 10 o 30 mM de APAP ( < 0.0001), lo que indica una toxicidad dependiente de la dosis inducida por APAP. La liberación de prostaglandina E2 mostró un aumento significativo a 30 mM de APAP ( < 0.05), lo que sugiere una reacción inflamatoria hacia un mayor estrés celular. La expresión de genes involucrados en el metabolismo de fármacos, reacciones antioxidantes, síntesis de urea y apoptosis fue influenciada diferencialmente por la exposición a APAP. Los exámenes histológicos revelaron que las células hepáticas humanas primarias en los biorreactores de control no tratados se reorganizaron en agregados celulares tipo tejido. Estos agregados se desintegraron parcialmente tras el tratamiento con APAP, careciendo de expresión de proteínas y transportadores específicos de hepatocitos. En conclusión, nuestros resultados validan la idoneidad del biorreactor hepático en 3D a escala micro para detectar efectos hepatotóxicos de fármacos in vitro bajo condiciones de perfusión.