La biofortificación de cereales es una solución potencial para aumentar los niveles de Se en la dieta humana. Aquí evaluamos si la aplicación de selenato y fuentes orgánicas de N y S a través de foliar altera el contenido y las especies de Se en el grano de trigo duro. Los ensayos de campo se realizaron en un ambiente mediterráneo en 2017-2018 y 2018-2019 en variedades antiguas (Cappelli y Saragolla antigua) y modernas (Marco Aurelio y Nadif) de trigo duro. Se evaluaron cuatro estrategias de fertilización orgánica: el control (harina de sangre seca en la siembra), la aplicación de S foliar (Bio-sulfuro en hoja bandera) y N (harina de sangre líquida al principio de la espigazón), y su uso combinado en interacción con una aplicación foliar de selenato en la etapa de encañado. El contenido de Se en el grano se determinó utilizando ICP-MS y su especiación a lo largo de HPLC-ICP-MS y HPLC-ESI-MS/MS. En 2018, la menor precipitación en los diez días antes de la aplicación foliar de Se causó una mayor acumulación de Se en el grano (1,63 vs. 1,44 mg kg en 2017-2018 y 2018-2019, respectivamente). Se observó un efecto negativo del S foliar orgánico en el contenido de Se en el grano (-24% con respecto al control). El moderno Nadif mostró el mayor contenido de Se (1,87 mg kg), seguido por la variedad antigua Cappelli (1,57 mg kg). Finalmente, el análisis de especiación de Se mostró la presencia de SeMet y SeMetSeCys. La fertilización orgánica afectó solo a SeMet, con valores más bajos bajo la fertilización orgánica de S y valores más altos bajo la fertilización orgánica de N.