La baja temperatura combinada con baja luz (estrés LL) es un estrés ambiental típico que limita la productividad, el rendimiento y la calidad de los pimientos en el noroeste de China. La glicina betaína (GB), una sustancia osmorreguladora, tiene efectos cada vez más valiosos en la resistencia al estrés de las plantas. En este estudio, se trataron plántulas de pimiento con diferentes concentraciones de GB bajo estrés LL, y 20 mM de GB fue el mejor tratamiento. Para explorar más a fondo el mecanismo de la GB en respuesta al estrés LL, se investigaron cuatro tratamientos, incluyendo CK (temperatura y luz normales, 28/18 grados C, 300 mol m s), CB (temperatura y luz normales + 20 mM de GB), LL (10/5 grados C, 100 mol m s) y LB (10/5 grados C, 100 mol m s + 20 mM de GB), en términos de crecimiento del pimiento, acumulación de biomasa, capacidad fotosintética, niveles de expresión de proteínas codificadas, permeabilidad de la membrana celular, expresión y actividad de genes de enzimas antioxidantes, y localización subcelular. Los resultados mostraron que la pre-aplicación de GB bajo estrés LL alivió significativamente la inhibición del crecimiento de las plántulas de pimiento; aumentó la altura de la planta en un 4.64%; aumentó la actividad de las raíces en un 63.53%; y disminuyó la fotoinhibición al aumentar el contenido de clorofila; regulando al alza los niveles de expresión de proteínas codificadas en un 30.29%, 36.69%, 18.81%, 30.05%, 9.01%, 6.21% y 16.45%, respectivamente; mejorando la intensidad de fluorescencia (curvas OJIP), la eficiencia fotocanica (Fv/Fm, Fv/Fm), qP y NPQ; mejorando la distribución de energía luminosa de PS (Y(II), Y(NPQ) y Y(NO)); y aumentando la fracción de reacción fotocanica y reduciendo la disipación de calor, aumentando así la altura de la planta en un 4.64% y la bioacumulación de brotes en un 13.55%. La pre-aplicación de GB bajo estrés LL también reguló al alza la expresión génica de SOD, POD y CAT; aumentó la actividad de la capacidad de eliminación de ROS en las hojas de pimiento; y coordinadamente aumentó la actividad de SOD en las mitocondrias, la actividad de POD en las mitocondrias, cloroplastos y citosol, y la actividad de CAT en el citosol, lo que mejoró la resistencia al LL de las plantas de pimiento al reducir los niveles de HO, O, MDA y proteínas solubles en las células foliares, lo que llevó a una reducción del daño en las membranas biológicas. En general, la pre-aplicación de GB alivió eficazmente los efectos negativos del estrés LL en las plántulas de pimiento.