La alimentación animal a través de la reutilización de subproductos agroindustriales es uno de los objetivos finales de la agricultura sostenible. El orujo de aceite de oliva (OOP), producido como un subproducto durante la molienda del aceite de oliva, se ha utilizado como ingrediente en la dieta de vacas lecheras Holstein. Hallazgos recientes no han mostrado disminución en el rendimiento animal, la ingesta de alimento ni efectos perjudiciales en la microbiota ruminal. En contraste, se ha observado una mejora en los ácidos grasos poliinsaturados C18. En este trabajo, se determinó y comparó el contenido de proteínas de la leche de vacas alimentadas con una dieta comercial (CON) o una experimental suplementada con OOP, y se analizaron los péptidos derivados de la digestión gastrointestinal simulada de la leche cruda. Después de la fraccionamiento a través de RP-HPLC, los péptidos fueron caracterizados por su actividad biológica en diferentes líneas celulares. La capacidad de reducir tanto el contenido de ROS intracelular como la expresión de marcadores inflamatorios, como la ciclooxigenasa, isoenzima 2 (COX-2) y la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS), así como las notables propiedades para inducir la diferenciación celular y ralentizar la proliferación de células cancerosas intestinales humanas, nos permite definirlos como péptidos bioactivos. A pesar de no haber observado diferencias significativas entre la actividad saludable de los péptidos CON y OOP, los resultados nos permiten ampliar el conocimiento sobre la actividad biológica de estos péptidos bioactivos y confirmar que los subproductos agroindustriales pueden ser incorporados con éxito en la estrategia de alimentación de las vacas lecheras.