La acuicultura es una industria agroalimentaria en rápida expansión que enfrenta pérdidas económicas sustanciales debido a brotes de enfermedades infecciosas, como infecciones bacterianas. Estos brotes causan interrupciones y altas mortalidades en varias etapas del proceso de cría, especialmente en las etapas larvales. Las bacterias probióticas están surgiendo como estrategias alternativas o complementarias prometedoras y sostenibles a la vacunación y el uso de antibióticos en acuicultura. En este estudio, se aislaron candidatos probióticos potenciales para la larvicultura de un tanque de cría de rotíferos utilizado como el primer alimento vivo para las larvas de rodaballo. Se seleccionaron dos aislamientos para una caracterización adicional debido a su amplia y fuerte actividad antimicrobiana contra varios ictiopatógenos, tanto Gram-positivos como Gram-negativos. Una extensa evaluación de seguridad in vitro de estos cuatro aislamientos reveló la ausencia de rasgos dañinos, como la resistencia antimicrobiana adquirida y otros factores de virulencia (es decir, actividades hemolíticas y de gelatinasa, deconjugación de sales biliares y degradación de mucina, así como detección por PCR de producción de aminas biogénicas). Además, los análisis de PCR de Consenso Intergénico Repetitivo de Enterobacterias (ERIC-PCR) revelaron su relación genética, mostrando dos grupos divergentes dentro de cada especie. Hasta donde sabemos, este trabajo informa por primera vez sobre el aislamiento y caracterización de Bacterias Ácido Lácticas (BAL) con potencial uso como probióticos en acuicultura a partir de tanques de cría de rotíferos, que tienen el potencial de optimizar la larvicultura de rodaballo e introducir nuevos enfoques de gestión microbiana para una acuicultura sostenible.