La identificación de nuevos biomarcadores en plasma humano sigue siendo una necesidad crítica para desarrollar y monitorear terapias farmacológicas en casi todas las áreas de enfermedades. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos biomarcadores plasmáticos se ve significativamente obstaculizado por la complejidad y el rango dinámico de las proteínas en el plasma, así como por la variabilidad inherente en la composición de un paciente a otro. Además, se acepta ampliamente que la mayoría de los biomarcadores plasmáticos solubles para enfermedades como el cáncer estarán representados por productos de fuga de tejido, circulando en el plasma a niveles bajos. Por lo tanto, es necesario encontrar enfoques con el nivel de sensibilidad requerido en una matriz biológica tan compleja. Se han sugerido estrategias para fraccionar el proteoma plasmático, pero las mejoras en sensibilidad a menudo se ven anuladas por la variabilidad del proceso resultante. Aquí describimos un enfoque utilizando cromatografía multidimensional y derivatización de proteínas en línea, que permite una mayor sensibilidad, al tiempo que minimiza la variabilidad del proceso. Para evaluar completamente este proceso automatizado, demostramos tres niveles de procesamiento y comparamos sensibilidad, rendimiento y reproducibilidad. Demostramos que el análisis de alta sensibilidad del proteoma plasmático humano es posible hasta niveles bajos de ng/mL o incluso altos de pg/mL con un alto grado de reproducibilidad técnica.