Antecedentes: Los aptámeros de ADN sintético son una clase de moléculas con aplicaciones potenciales en medicina, sirviendo como sensores moleculares o ligandos para la entrega de medicamentos dirigida. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es una tecnología para seleccionar aptámeros funcionales que se informó por primera vez hace tres décadas y ha sido desarrollada activamente desde entonces. SELEX implica múltiples iteraciones de dos pasos fundamentales: (i) particionamiento basado en la afinidad del objetivo de aptámeros de una biblioteca aleatoria y (ii) amplificación de aptámeros seleccionados por PCR, seguida de aislamiento de ADN de cadena sencilla (ssDNA). Los protocolos de SELEX se han diversificado considerablemente, con numerosas variaciones posibles para cada paso. Esta heterogeneidad hace que sea desafiante identificar métodos óptimos. Por lo tanto, el análisis comparativo de diferentes enfoques para las etapas principales de SELEX es de considerable importancia práctica. Métodos: Se realizaron en paralelo cuatro métodos ampliamente utilizados para la generación de ssDNA: (a) PCR seguido de digestión de la hebra antisentido con exonucleasa lambda, (b) PCR con un cebador extendido seguido de separación de hebras dependiente del tamaño utilizando PAGE desnaturalizante, (c) PCR asimétrico y (d) PCR asimétrico con un bloqueador de cebador. Resultados: Se compararon la especificidad, eficiencia, reproducibilidad y duración de cada método. Conclusiones: El PCR asimétrico con un bloqueador de cebador arrojó los resultados más favorables.