Actualmente, la inmunoterapia es una de las estrategias de tratamiento más efectivas para el cáncer. Sin embargo, la eficacia de cualquier inmunoterapia antitumoral específica puede variar según las características dinámicas de las células inmunitarias, como su velocidad de migración e interacciones célula a célula. Por lo tanto, comprender la dinámica entre las células involucradas en la respuesta inmunitaria puede informar sobre la optimización y mejora de las estrategias de inmunoterapia existentes. Las tecnologías de imágenes in vivo utilizan técnicas de microscopía óptica para visualizar el movimiento y comportamiento de las células in vivo, incluidas las células involucradas en la respuesta inmunitaria, mostrando así un gran potencial para su aplicación en el campo de la inmunoterapia contra el cáncer. En esta revisión, presentamos brevemente los aspectos técnicos necesarios para la imagen in vivo, como el etiquetado de proteínas fluorescentes, la construcción de ratones transgénicos y varios modelos de cámaras de ventana. Luego, discutimos la elucidación de nuevos fenómenos y mecanismos relacionados con la inmunoterapia tumoral que ha sido posible gracias a la aplicación de la tecnología de imagen in vivo. Específicamente, la imagen in vivo ha respaldado la caracterización del movimiento de las células T durante la terapia con inhibidores de puntos de control inmunitario y el análisis cinético de la migración de las células dendríticas en la terapia de vacunas contra el tumor. Finalmente, ofrecemos una perspectiva sobre los desafíos y futuras direcciones de investigación para el uso de la tecnología de imagen in vivo en la inmunoterapia contra el cáncer.