Este estudio explora un enfoque para diseñar y preparar un andamio multicapa que imita el tejido natural interestratificado. Este constructo multicapa, compuesto por matrices de quitosano con concentraciones graduadas de nanohidroxiapatita, se logró a través de un proceso de biomineralización in situ aplicado a capas individuales. Se consideraron tres concentraciones de precursores distintas, lo que resultó en un contenido de nanohidroxiapatita del 10, 20 y 30% en cada capa. Los andamios resultantes de quitosano/nanohidroxiapatita (Cs/n-HAp), creados mediante liofilización, exhibieron nucleación de nanohidroxiapatita, distribución homogénea, propiedades mecánicas mejoradas y buena citocompatibilidad. El análisis de citocompatibilidad reveló que las capas de Cs/n-HAp presentaron proliferación celular similar al control en Cs puro para las muestras con un 10% de n-HAp, lo que indica buena citocompatibilidad a esta concentración, mientras que no se demostró inducción de vías de muerte apoptótica hasta una concentración del 20% de n-Hap. El exitoso ensamblaje multicapa de Cs y capas de Cs/n-HAp resaltó que el enfoque propuesto representa una estrategia prometedora para imitar tejidos multifacéticos, como los osteocondrales.