Los modelos de cultivo celular tridimensionales (3D) se utilizan ampliamente para proporcionar un microentorno más fisiológicamente relevante en el que albergar y estudiar los tipos de células deseados. Estos modelos varían en complejidad y costo, desde sistemas simples y económicos hasta sistemas altamente sofisticados y costosos. En este estudio, presentamos un novedoso andamiaje de nanocelulosa apilado multicompartmentalizado y translúcido y describimos su fabricación, caracterización y aplicación potencial para el co-cultivo de múltiples tipos de células. El andamiaje consiste en capas de nanocelulosa bacteriana (BNC) separadas por intercapas de una menor densidad de fibras de nanocelulosa. Usando este sistema, co-cultivamos la línea celular MDA-MB-231 con dos tipos de células asociadas a tumores, a saber, BC-CAFs y macrófagos M2, para simular el microentorno tumoral (TME). Las células permanecieron viables y metabólicamente activas durante hasta 15 días. La microscopía confocal no mostró signos de invasión celular. Sin embargo, se observaron con frecuencia BC-CAFs y células MDA-MB-231 dentro de la misma capa. Se analizó la expresión de genes relacionados con el cáncer de mama para evaluar la funcionalidad posterior de las células. Encontramos que la expresión de E-cadherina era un 20% más baja en las células cancerosas co-cultivadas en el andamiaje multicompartmentalizado que en aquellas cultivadas en placas 2D. Dado que la E-cadherina desempeña un papel crítico en la prevención de la disociación inicial de las células epiteliales de la masa tumoral primaria y a menudo se regula a la baja en el microentorno tumoral in vivo, este hallazgo sugiere que nuestro andamiaje recapitula de manera más efectiva la complejidad de un microentorno tumoral.