La marchitez por Phytophthora del pimiento es una enfermedad notoria causada por el patógeno oomiceto, que representa una gran amenaza para la producción global de pimientos. Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica al alterar la eficiencia de traducción o la estabilidad de los ARNm objetivo, que desempeñan roles importantes en la regulación de la respuesta de una planta a los patógenos. En este estudio, se construyeron bibliotecas de mRNA-seq y bibliotecas de small RNA-seq utilizando raíces de pimiento de la línea resistente CM334 y de la línea susceptible EC01 inoculadas a las 0, 6, 24 y 48 horas después de la inoculación, respectivamente. Para el análisis de mRNA-seq, se identificaron un total de 2159 y 2971 genes expresados diferencialmente (DEGs) en CM334 y EC01, respectivamente. Para el análisis de miRNA-seq, se identificaron 491 miARN de pimiento, incluidos 330 miARN conocidos y 161 miARN nuevos. Entre ellos, se identificaron 69 y 88 miARN expresados diferencialmente (DEMs) en CM334 y EC01, respectivamente. El examen de los DEMs y sus objetivos reveló 22 redes regulatorias, que presentan predominantemente miARNs regulados al alza correspondientes a genes objetivo regulados a la baja. Notablemente, estas redes regulatorias DEM-DEG mostraron una superposición significativa entre CM334 y EC01, sugiriendo que podrían contribuir a la defensa basal del pimiento. Además, cinco DEMs seleccionados (miR166, miR1171, miR395, miR530 y miRN2) y sus genes objetivo fueron validados mediante qRT-PCR, confirmando una correlación negativa consistente en los patrones de expresión de los miARN y sus objetivos. Este análisis integral proporciona nuevas perspectivas sobre las redes regulatorias de los miARN y sus objetivos, ofreciendo contribuciones valiosas a nuestra comprensión de los mecanismos de defensa del pimiento.