La alfalfa (L.) es un cultivo forrajero importante en todo el mundo, pero la investigación en genética molecular y mejoramiento en esta especie se ve obstaculizada por su autoincompatibilidad (AI). Aunque los mecanismos subyacentes a la AI han sido estudiados extensamente en otras familias de plantas, la AI en leguminosas, incluida la alfalfa, sigue siendo poco comprendida. Aquí, determinamos que los tubos polínicos autopolinizados podían germinar en el estigma de la alfalfa, crecer a través del estilo y alcanzar la cavidad ovárica, pero los óvulos colapsaron aproximadamente 48 horas después de la autopolinizacion. Un análisis transcriptómico de pistilos disecados 24 horas después de la autopolinizacion identificó 941 genes expresados de manera diferente (GEDs), incluidos 784 genes sobreexpresados y 157 genes subexpresados. Un análisis de ontología genética (GO) mostró que los GEDs estaban altamente enriquecidos en funciones asociadas con la regulación del crecimiento de los tubos polínicos y la germinación del polen. Un análisis de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) indicó que la interconversión de pentosas y glucuronatos, la transducción de señales de hormonas vegetales, el spliceosoma y los ribosomas podrían desempeñar roles importantes en la AI. Nuestro análisis de coexpresión mostró que las proteínas F-box, las quinasas de proteínas serina/treonina, las quinasas de proteínas dependientes de calcio (CDPKs), bHLHs, bZIPs y las proteínas de la familia MYB relacionadas probablemente estaban involucradas en la respuesta a la AI. Nuestro estudio proporciona un catálogo de genes candidatos para un estudio adicional para comprender la AI en la alfalfa y leguminosas relacionadas.