El esperma de carnero experimenta una secuencia de cambios fisiológicos y bioquímicos denominados colectivamente como capacitación para realizar la fertilización del oocito. Sin embargo, los cambios proteicos inducidos por la capacitación aún necesitan ser explorados más a fondo. Así, el presente estudio investigó el perfil proteómico comparativo en espermatozoides de carnero bajo condiciones no capacitantes (NC) y capacitantes (CAP) in vitro utilizando una estrategia de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem combinada con etiquetado por tándem de masas. Como resultado, se identificaron y cuantificaron 2050 proteínas; 348 de ellas eran de abundancia diferencial, con 280 de las proteínas reguladas al alza y 68 de las proteínas reguladas a la baja entre los espermatozoides CAP y NC, respectivamente. El análisis de enriquecimiento funcional indicó que las proteínas de abundancia diferencial Prune Exopolyphosphatase 1, Galactose-1-Phosphate Uridylyltransferase y ATP Citrate Lyase estaban estrictamente relacionadas con la producción y conversión de energía, y Phosphoglycolate phosphatase, Glucosamine-6-Phosphate Deaminase 1 y 2 estaban relacionadas con el metabolismo, el procesamiento de ARN y las vías de transporte vesicular. Además, las redes de interacción proteína-proteína indicaron una fuerte interacción entre estas proteínas diferenciales en vías anotadas como el metabolismo del ubiquitina y el transporte. Nuestros hallazgos indican que el progreso de la capacitación podría estar regulado a través de diferentes vías, proporcionando información sobre los mecanismos involucrados en la capacitación y fertilidad del esperma de carnero.