El cribado neonatal para la fenilcetonuria (PKU, OMIM: 261600) se introdujo a finales de la década de 1960. Desarrollamos una prueba molecular rápida y simple para las mutaciones más frecuentes del gen de la fenilalanina hidroxilasa (, ID del gen: 5053). Utilizando este método para detectar las 18 mutaciones más frecuentes, es posible lograr una tasa de detección del 75% en la población italiana. Las variantes seleccionadas también alcanzan una alta tasa de detección en otras poblaciones, por ejemplo, 70% en el sur de Alemania, 68% en el oeste de Alemania, 76% en Dinamarca, 68% en Suecia, 63% en Polonia y 60% en Bulgaria. Aplicamos con éxito esta prueba de confirmación en el cribado neonatal para las hiperfenilalaninemias utilizando manchas de sangre seca y obtuvimos el genotipo en aproximadamente 48 h. Se encontró que el método es adecuado como prueba de segundo nivel en el cribado neonatal para las hiperfenilalaninemias en neonatos con una prueba de cribado positiva. Esta prueba también puede ser útil para el cribado de portadores porque puede omitir toda la secuencia de codificación y el secuenciación de los límites de intrón-exón, superando así las cuestiones que implica este enfoque, como las interpretaciones de nuevas variantes.