El hígado es un órgano complejo que gobierna muchos tipos de metabolismo, incluido el metabolismo energético y otros procesos celulares. El hígado también desempeña un papel crucial en funciones importantes en la inmunidad, y la actividad de la inmunidad asociada al tejido hepático afecta el resultado de muchas patologías hepáticas. Una caracterización exhaustiva del microambiente inmunitario del hígado puede contribuir a una mejor comprensión de la señalización inmunitaria, los mecanismos de respuestas inmunitarias específicas e incluso a predicciones mejoradas sobre los resultados terapéuticos. En este documento, presentamos un protocolo optimizado, simple y rápido para caracterizar el entorno inmunitario asociado al hígado. Creemos que la técnica más adecuada para obtener una suspensión de células inmunitarias complejas y para eliminar las células sanguíneas contaminantes es realizar la perfusión del hígado de ratón, utilizando solo solución salina con fosfato. La combinación de una digestión enzimática y una disociación mecánica del tejido hepático, seguida de la purificación de células, mejora las aplicaciones posteriores. Esta combinación es un requisito previo esencial para la determinación y caracterización de las células inmunitarias. Luego demostramos una inmunofenotipificación multiparamétrica basada en citometría de flujo junto con una estrategia de selección para detectar y cuantificar células endoteliales hepáticas, células T (auxiliares y citotóxicas), células B, células NK, células NKT, neutrófilos, monocitos (incluidos subconjuntos), células dendríticas (incluidos subconjuntos), macrófagos y células de Kupffer.