Los uniportadores de calcio mitocondrial (MCUs) son una familia de transportadores unidireccionales de calcio importantes para las señales de Ca en el citoplasma. Aunque se han investigado las proteínas MCU en varias especies de plantas, falta un análisis a nivel genómico en la alfalfa. Aquí, a través de un análisis a nivel genómico, se identificaron un total de 5, 20 y 6 genes en tres cultivares diferentes de alfalfa, a saber, Jemalong A17, XinJiangDaYe y Zhongmu No. 1, respectivamente. Se clasificaron filogenéticamente en tres subfamilias. La mayoría de los genes tienen solo un intrón, y se observaron eventos de duplicación de genes dentro de cada acceso de alfalfa y entre diferentes accesos. Todas las proteínas MCU de alfalfa contenían un dominio MCU altamente conservado y 10 motivos conservados, con dos dominios transmembrana y un motivo DI/VME. Según los datos de expresión tisular de Zhongmu No. 1, fue el transcrito más abundante con la mayor expresión en la hoja, y mostró niveles de expresión más altos en el tallo que en otros tejidos. Analizamos los perfiles de expresión de cinco genes bajo estrés por sal, sequía y frío a través de ensayos de qRT-PCR. Todos los cinco genes fueron inducidos por estrés de sequía, excepto MsMCU5, cuya expresión fue regulada al alza por estrés salino, mientras que el estrés por frío alteró ligeramente la expresión de MsMCU. Se predijeron nueve proteínas potencialmente interactivas y tres miARNs que las apuntan. Estos resultados proporcionan un conocimiento detallado de los genes de alfalfa y sugieren sus funciones potenciales en la respuesta al estrés abiótico.