El cártamo (L.) es un cultivo económico de múltiples usos. Los glucósidos flavonoides son sus principales constituyentes bioactivos, y se han identificado varias glicosiltransferasas involucradas en su biosíntesis. La subfamilia de glicosiltransferasa 84 representa una rama especializada con diversas funciones, involucrada no solo en la catalización de la glicosilación de flavonoides, sino también en la biosíntesis de auxinas, taninos y otros compuestos. Sin embargo, esta subfamilia sigue estando poco caracterizada en el cártamo. En este estudio, se seleccionaron dos genes de la subfamilia UGT84, y , basándose en patrones de expresión y análisis de evolución filogenética. Se indujeron y purificaron proteínas recombinantes utilizando sistemas de expresión procariota. Posteriormente, se realizó una caracterización funcional a través de ensayos enzimáticos in vitro y expresión transitoria en hojas de tabaco. Se empleó acoplamiento molecular para investigar los modos de unión de las UGTs con UDP-glucosa. Los resultados indicaron que ambas UGTs demostraron actividad de glicosilación en la posición 7-OH del flavonoide. Notablemente, cuando se utilizó luteolina como el aglicona, ambas enzimas también exhibieron actividad de glicosilación 3-. Combinado con el alineamiento de secuencias de aminoácidos, proponemos que los residuos A351/T343 y G263/F254, que afectan la conformación espacial y la capacidad de formación de enlaces de hidrógeno, pueden ser una de las razones de las diferencias funcionales entre estas dos enzimas. Estos hallazgos proporcionan nuevas perspectivas sobre la diversidad catalítica de las glicosiltransferasas.