Los ARN de horquilla corta (shRNAs) son herramientas potentes para silenciar genes, ofreciendo un potencial terapéutico para aplicaciones de terapia génica y celular. Sin embargo, su eficacia y seguridad dependen de un procesamiento preciso por parte de la maquinaria de interferencia de ARN y la generación de mínimos subproductos. En este protocolo, describimos cómo analizar sistemáticamente el procesamiento de pequeños ARN terapéuticos por DROSHA y DICER1 y su incorporación en complejos AGO funcionales. Utilizando secuenciación estándar de pequeños ARN y análisis bioinformático personalizado (QuagmiR), evaluamos los diferentes pasos de maduración de shRNA que influyen en la eficiencia y especificidad del procesamiento. Proporcionamos pautas para solucionar problemas comunes de diseño y efectos secundarios no deseados en perfiles de transcripción a nivel de transcriptoma para identificar el direccionamiento no intencionado de ARNm a través del efecto similar al miARN. Proporcionamos ejemplos del análisis bioinformático que se puede realizar para caracterizar shRNA terapéuticos. Finalmente, ofrecemos pautas para solucionar diseños de shRNA que resulten en un procesamiento subóptimo o efectos secundarios no deseados. Este protocolo subraya la importancia de un diseño racional de shRNA para mejorar la especificidad y reducir los subproductos de biogénesis que pueden provocar efectos secundarios, proporcionando un marco para optimizar el uso de pequeños ARN en terapias génicas y celulares.