Los glucosinolatos (GSLs), metabolitos secundarios cruciales en verduras crucíferas, se hidrolizan al ser consumidos o dañados mecánicamente, formando compuestos bioactivos con propiedades anticancerígenas, como el glucorafanina (GRA). Entre las verduras crucíferas, el brócoli destaca por su alto contenido de GSL, que varía significativamente entre diferentes genotipos. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar y cuantificar los compuestos de glucosinolato en brócoli utilizando LC-HRMS2 y UPLC. Identificamos trece GSLs en 191 genotipos de brócoli, incluyendo siete glucosinolatos alifáticos, cinco indoles y un aromático. El contenido de GSL en estos genotipos varió de 0.1705 a 5.8174 mg/g (PS). También exploramos la diversidad y contenido de GSL en siete órganos de desarrollo, encontrando una alta diversidad y contenido en raíces de plántulas y floretes. Notablemente, el genotipo No. 300 tuvo el mayor contenido de GSL (5.8174 mg/g, PS) y GRA (3.1545 mg/g, PS), junto con un mayor diámetro de bulbo floral (13.4 cm) y un período de crecimiento más corto (11 días), demostrando su potencial para la cría de brócoli rico en GRA. Hasta donde sabemos, este estudio abarca el mayor número de genotipos de brócoli hasta la fecha, ampliando nuestra comprensión de la diversidad y contenido de GSL en el brócoli. Estos hallazgos pueden proporcionar recursos valiosos para futuras crías o el cultivo comercial de brócoli rico en GRA.