El centeno exhibe una alta diversidad en la coloración del grano entre los cereales pequeños, lo que está principalmente relacionado con la presencia de flavonoides coloreados sintetizados en las capas externas del grano. Esta variabilidad aún no se ha descrito suficientemente desde los puntos de vista colorimétrico, citológico y bioquímico. En este estudio, se analizó la localización de los pigmentos flavonoides, antocianinas y proantocianidinas (PAs), a través de diferentes tejidos del grano en 26 líneas de centeno con genes de color de grano antocianínico identificados. La coloración del grano se caracterizó objetivamente utilizando las coordenadas de color CIELAB y el software GrainScan para el análisis de imágenes de granos individuales. La distribución de antocianinas y PAs se investigó mediante microscopía de luz y espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-IMS) en secciones longitudinales y transversales de los granos. Los resultados revelaron que las líneas de grano violeta acumulan antocianinas en el pericarpio, mientras que las líneas de grano verde contienen antocianinas en la capa de aleurona. MALDI-IMS confirmó la presencia de antocianinas específicas: cianidinas en el pericarpio de las líneas de grano violeta y delfinidinas en la capa de aleurona de las líneas de grano verde. Todas las líneas estudiadas, excepto los mutantes vi3 sin antocianinas, exhibieron PAs en la testa de color marrón. Cuatro grupos de color principales de los granos de centeno (amarillo, verde, marrón y violeta) pudieron diferenciarse claramente utilizando el ángulo h de las coordenadas de color CIE.