La proteína de choque térmico 20 (HSP20) actúa como un chaperón y desempeña roles en numerosos procesos biológicos, pero el sesgo en el uso de codones (CUB) de sus genes ha permanecido inexplorado. Este estudio identificó 140 genes de cuatro especies crucíferas, que fueron identificados a partir de la base de datos de plantas Ensembl, y posteriormente investigamos su CUB. Como resultado, el análisis de composición de bases reveló que el contenido general de GC de los genes estaba por debajo del 50%. El contenido general de GC se correlacionó significativamente con los constituyentes en tres posiciones de codones, lo que implica que tanto la presión de mutación como la selección natural podrían contribuir al CUB. Los valores relativamente altos de ENc sugirieron que el CUB de los genes en las cuatro especies crucíferas era relativamente débil. Posteriormente, ENc mostró una correlación negativa con los niveles de expresión génica. Los análisis, incluyendo el análisis de gráficos de ENc, análisis neutral y sesgo PR2, revelaron que la selección natural moldeó principalmente los patrones de CUB de los genes en estas especies. Además, se identificaron un total de 12 codones óptimos (RSCU > 0.08 y RSCU > 1) en las cuatro especies. Un análisis filogenético de vecino-uniendo basado en secuencias codificantes (CDS) mostró que los 140 genes se agruparon estricta y distintivamente en 12 subfamilias. El análisis de componentes principales y el análisis de clúster basado en valores de uso sinónimo relativo de codones (RSCU) apoyaron el hecho de que el patrón de CUB era consistente con la relación genética a nivel de genes y (o) especies. Estos resultados no solo enriquecerán el recurso genético, sino que también avanzarán nuestra comprensión del CUB de los genes, que puede subyacer a la base teórica para la exploración de su patrón genético y evolutivo.