La implementación de la metabarcodificación de ADN y el ADN ambiental (eDNA) para la evaluación de la biodiversidad y el biomonitoreo de ecosistemas acuáticos tiene un gran potencial en todo el mundo. Sin embargo, la metabarcodificación de ADN y el eDNA dependen en gran medida de la cobertura de las bibliotecas de referencia de códigos de barras de ADN, que actualmente se ven obstaculizadas por la falta sustancial de secuencias de referencia. El objetivo principal de este estudio fue analizar la cobertura actual de las bibliotecas de referencia de códigos de barras de ADN para especies de fitoplancton de la ecorregión acuática mediterránea en el sureste de Italia (Región de Apulia) con el fin de evaluar la aplicabilidad de la metabarcodificación de ADN y el eDNA en esta área. Para ello, investigamos tres bibliotecas de referencia de códigos de barras de ADN principales, BOLD Systems, GenBank y SILVA, para la disponibilidad de códigos de barras de ADN de las especies de fitoplancton examinadas. Se realizó un análisis de brechas para tres marcadores genéticos moleculares, 18S, 16S y COI. Los resultados mostraron una falta considerable de códigos de barras para los tres marcadores. Sin embargo, entre los tres marcadores, el 18S tuvo una mayor cobertura en las bibliotecas de referencia. Para el marcador genético 18S, la brecha de cobertura de códigos de barras en los tres tipos de ecosistemas examinados fue del 32.21-39.68%, del 60.12-65.19% para el marcador genético 16S, y del 72.44-80.61 para el marcador genético COI. Posteriormente, la distancia genética interespecífica examinada en el marcador molecular más representado, 18S, pudo distinguir el 80% de las especies extraídas para lagos y el 70% para aguas marinas y transicionales. En conclusión, este trabajo destaca la importancia de llenar las brechas en las bibliotecas de referencia y constituye la base para el avance de la metabarcodificación de ADN y la aplicación de eDNA para la evaluación de la biodiversidad y el biomonitoreo.