El objetivo de este trabajo es caracterizar Nephilengys cruentata en relación con el número diploide, la morfología cromosómica, el tipo de sistema cromosómico de determinación sexual, los cromosomas portadores de las Regiones Organizadoras Nucleolares (NOR), el patrón de bandeo C y las secuencias repetitivas AT o GC. Las preparaciones cromosómicas se sometieron a tinción estándar (Giemsa), impregnación argéntica de NOR, técnica de bandeo C y tinción con fluorocromo específico de base. El análisis de las células mostró 2n = 24 y 2n = 26 cromosomas en los embriones, y 2n = 26 en las células ováricas, siendo todos los cromosomas acrocéntricos. El brazo largo de los pares 1, 2 y 3 mostró una extensa área heteropicnótica negativa al teñir las metafases mitóticas con Giemsa. Los cromosomas sexuales no mostraron características diferenciales que permitieran distinguirlos de los demás cromosomas del complemento. Considerando el número de cromosomas diploides encontrados en N. cruentata y la prevalencia del sistema cromosómico de determinación sexual X1 X2 en Tetragnathidae, N. cruentata parece poseer 2n = 24 = 22 + X1 X2 en los machos y 2n = 26 = 22 + X1 X1 X2 X2 en las hembras. Los pares 1, 2 y 3 mostraron NOR que coinciden con los patrones heteropicnóticos negativos. Utilizando la técnica de bandas C, la región pericentromérica de los cromosomas reveló una pequeña cantidad o incluso ausencia de heterocromatina constitutiva, a diferencia del patrón de bandas C descrito en otras especies de arañas. En N. cruentata, los fluorocromos DAPI/DA, DAPI/MM y CMA3/DA revelaron que la heterocromatina constitutiva es rica en bases AT y los NOR poseen secuencias repetitivas de bases GC.