Para mejorar la eficiencia de utilización de la paja de colza, se realizó una alcalinización anaeróbica con óxido de calcio (CaO) y se aplicó espectroscopia molecular avanzada para detectar los cambios estructurales moleculares internos. La paja de colza se trató con diferentes combinaciones de CaO (3%, 5% y 7%) y niveles de humedad (50% y 60%) y se almacenó en condiciones anaeróbicas. Investigamos los constituyentes químicos de carbohidratos, la cinética de degradación de la fibra detergente neutra ruminal (aNDF) y la fibra detergente ácida (ADF), y las características estructurales moleculares de los carbohidratos. Los grupos tratados con CaO mostraron mayores ( < 0.05) contenidos de cenizas, Ca, carbohidratos no fibrosos, fibra soluble y degradabilidad ruminal de aNDF y ADF. En contraste, fueron menores ( < 0.05) los contenidos de aNDF, ADF y fibra indigerible. Con el aumento de los niveles de CaO del 3% al 7%, el contenido de aNDF y ADF disminuyó linealmente ( < 0.05). El tratamiento con CaO y el almacenamiento anaeróbico cambiaron las características moleculares, incluidos los parámetros estructurales relacionados con los carbohidratos totales (TC), compuestos celulósicos (CEC) y carbohidratos estructurales (STC). Las alteraciones en las regiones espectrales de los compuestos celulósicos estaban altamente correlacionadas con las diferencias en los constituyentes químicos de carbohidratos y la digestibilidad ruminal de la paja de colza. En resumen, el tratamiento con CaO y el almacenamiento anaeróbico alteraron los parámetros estructurales moleculares de los carbohidratos, lo que llevó a una mejora en la degradabilidad efectiva (ED) de aNDF y ADF en la paja de colza. Desde la perspectiva del costo y la efectividad del procesamiento, se podría sugerir una combinación de tratamiento de 5% de CaO + 60% de humedad como recomendación.