La leishmaniasis visceral causada por el protozoo es una enfermedad transmitida entre perros y humanos. Las técnicas actuales de muestreo de ganglios linfáticos no son capaces de proporcionar cantidades suficientes de muestras para pruebas de laboratorio. Por lo tanto, evaluamos la punción con aguja semiautomática como una herramienta novedosa para recolectar muestras de ganglios linfáticos para el diagnóstico de leishmaniasis visceral canina. Esta técnica utiliza una aguja gruesa para aumentar la cantidad de muestra y se comparó con muestras recolectadas del mismo ganglio linfático mediante aspiración con una aguja fina y por necropsia. Se procesaron muestras de ganglios linfáticos de 30 perros seropositivos para su uso en las siguientes pruebas de laboratorio: cultivo, inmunohistoquímica e histopatología. Se detectó el spp. por inmunohistoquímica en el 70% de las muestras y por histopatología en el 33%. La positividad del cultivo fue del 77% para las muestras obtenidas por necropsia (87% en la primera semana), 73% para las muestras obtenidas por aspiración con aguja fina (82% en la primera semana) y 63% para las muestras obtenidas mediante punción con aguja semiautomática (95% en la primera semana). La combinación de punción con aguja semiautomática y cultivo es una alternativa para la detección de spp. en los ganglios linfáticos de los perros debido a su eficiencia, practicidad y resultados rápidos.