La toma de muestras de sangre en roedores es una práctica común en estudios científicos. Algunos de los métodos refinados más utilizados son la punción de la vena safena o la vena caudal, o incluso la amputación de la cola. Las necesidades de manejo de estos diferentes métodos de toma de muestras de sangre son distintas y pueden afectar directamente el estrés, aumentando la variabilidad del estudio. Además, hay menos aversión y estrés si el animal está acostumbrado al entorno, al manejo y a la técnica. Por lo tanto, nuestro estudio tuvo como objetivo evaluar la influencia de estas tres técnicas de toma de muestras de sangre (punción de la safena, punción de la vena caudal y amputación de la cola) y el uso de aclimatación previa en diferentes indicadores de estrés animal, evaluando las concentraciones de glucosa en sangre y los metabolitos de corticosterona fecal (FCMs). Veinticuatro ratones machos y hembras jóvenes adultos C57Bl6/J fueron divididos en tres grupos según el método de muestreo: grupo de amputación de cola (TD), grupo de punción de la vena safena (SV) y grupo de punción de la vena caudal (CV). Todos los ratones fueron estudiados con y sin aclimatación, que se realizó durante 9 días consecutivos. Los resultados mostraron que tanto machos como hembras presentan respuestas muy similares a los diferentes métodos de manejo y muestreo sin diferencias significativas. Sin embargo, la aclimatación en todos los métodos de muestreo disminuyó significativamente los niveles de glucosa y FCM. El método que obtuvo los niveles más bajos de glucosa y FCM con significancia fue la punción de la vena safena. Por lo tanto, podemos decir que causa menos estrés realizar una aclimatación previa, incluso cuando esto implica un mayor manejo del animal. Nuestros resultados contribuyen al refinamiento dentro del concepto de las 3R y podrían servir a los investigadores para programar y seleccionar una buena técnica de manejo y un método de toma de muestras de sangre amigable con el bienestar para sus experimentos.