El calabacín (L.) es uno de los principales cultivos hortícolas cultivados bajo cultivo protegido en el norte de China. El estrés por bajas temperaturas (LT) inhibe severamente el crecimiento de las plántulas de calabacín, lo que resulta en reducciones en el rendimiento y la calidad. Aquí, utilizando tres tipos diferentes de ácidos húmicos, incluyendo ácido húmico a base de carbón (CHA), ácido fúlvico (FA) y ácido húmico bioquímico (BHA), investigamos los efectos de los ácidos húmicos contra el estrés LT (5 grados C) en las plántulas de calabacín. El tratamiento con los tres tipos de ácidos húmicos mejora la tolerancia al estrés LT al disminuir el daño oxidativo mediante el aumento de las actividades de las enzimas antioxidantes y los contenidos de azúcar soluble y prolina en las plántulas de calabacín, especialmente después de la aplicación de BHA. El análisis transcriptómico comparativo reveló que un total de 17 genes diferencialmente expresados (DEGs) fueron comúnmente inducidos en las hojas de las plántulas de calabacín tratadas con FA, CHA y BHA bajo estrés LT, incluyendo calmodulina, factores de transcripción (TFs) sensibles al etileno, peroxidazas y 10 TFs, incluyendo dos y siete genes. En conjunto, estos resultados indicaron que la suplementación con ácidos húmicos reprograma el metabolismo de las plantas y modula la expresión de genes involucrados en la eliminación de ROS, el metabolismo de fitohormonas o las vías de señalización, mejorando finalmente la tolerancia al estrés LT en las plántulas de calabacín.