La preservación del semen implica alargar la vida fértil de los espermatozoides sin efectos perjudiciales en sus propiedades bioquímicas, funcionales y ultraestructurales. El almacenamiento líquido a 4 grados C es un método de preservación de esperma de carnero. Sin embargo, este método de almacenamiento causa daños irreversibles debido a choques por frío, estrés osmótico, estrés oxidativo y reducciones en el metabolismo de los espermatozoides. El presente estudio tiene como objetivo investigar si la suplementación con ácido mitocónico 5 (MA-5) en un diluyente de esperma podría mejorar la calidad del esperma de carnero enfriado y elucidar su mecanismo de acción. El esperma de carnero se diluyó con un diluyente de tris-citrato-glucosa que contenía diferentes concentraciones de MA-5 (0, 0.1, 1, 10 y 100 nM) y se almacenó a 4 grados C durante hasta 48 h. Se evaluaron la motilidad de los espermatozoides, la integridad de la membrana, la integridad del acrosoma, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS), el contenido de ATP y la expresión de las subunidades de la NADPH deshidrogenasa 1 (MT-ND1) y 6 (MT-ND6). Se observó que en comparación con el control, el tratamiento con 10 nM de MA-5 aumentó significativamente (< 0.05) la motilidad total (82 +/- 3.5% vs. 76 +/- 5.9%), la motilidad progresiva (67.6 +/- 8.2% vs. 51 +/- 8.3%) y otros parámetros (velocidad en línea recta (VSL), velocidad media de trayectoria (VAP) y velocidad curvilínea (VCL)). Además, la suplementación con 10 nM de MA-5 también mejoró la integridad de la membrana del esperma de carnero y la integridad acrosomal, así como aumentó el potencial de la membrana mitocondrial (51.1 +/- 0.7% vs. 37.7 +/- 1.3%), redujo los niveles de ROS y elevó los contenidos de adenosín trifosfato (ATP). Además, un análisis de Western blot demostró que la adición de MA-5 aumentó significativamente (< 0.05) la expresión de las proteínas MT-ND1 y MT-ND6 en el esperma de carnero, siendo el tratamiento con 10 nM de MA-5 el que resultó en el nivel de expresión más alto. Estos resultados sugieren que el MA-5 mejora la calidad del esperma de carnero al mantener una alta función mitocondrial de los espermatozoides durante el almacenamiento líquido a 4 grados C.