Varios estudios han sugerido los beneficios potenciales de la terapia fotodinámica (PDT) basada en ácido 5-aminolevulínico (5-ALA). El 5-ALA es un precursor del hemo, que genera especies reactivas de oxígeno (ROS) tras la fotoirradiación. Algunos informes indican que la luz azul induce la producción de ROS intracelular. En el presente estudio, elucidamos los efectos de la luz azul y el 5-ALA sobre la integridad del ADN en células de melanoma murino B16F1 y queratinocitos humanos HaCaT utilizando una variedad de técnicas de ensayo de cometas. El co-tratamiento con luz azul y 5-ALA disminuyó significativamente la viabilidad celular en ambas líneas celulares. Se realizó un ensayo de cometas neutro para evaluar la formación de roturas de doble cadena de ADN (DSB) y la luz azul y el 5-ALA causaron DSB. También realizamos un ensayo de cometas alcalinos para detectar roturas de cadena simple (SSB) y sitios lábiles alcalinos (ALS). Los resultados indicaron que el 5-ALA aceleró la formación de SSB inducida por la luz azul. Además, se realizaron ensayos de cometas modificados utilizando dos tipos de enzimas para evaluar daños oxidativos en el ADN. Los resultados indicaron que la luz azul y el 5-ALA generaron purinas y pirimidinas oxidadas en ambas líneas celulares. En resumen, el co-tratamiento con 5-ALA y fotoirradiación puede causar daños inesperados en el ADN en células y tejidos.