La acetilcolina (ACh) es un neurotransmisor que regula múltiples funciones en el sistema nervioso, y la evidencia emergente indica que podría desempeñar un papel en la progresión del cáncer. Sin embargo, esta función es controvertida. Anteriormente, mostramos que los pesticidas organofosforados disminuían los niveles de la enzima acetilcolinesterasa in vivo, aumentando los niveles séricos de ACh y la formación de tumores en las glándulas mamarias de ratas. Además, mostramos que la exposición a ACh en líneas celulares de cáncer de mama inducía la sobreexpresión del receptor de estrógeno alfa (ERalpha), una proteína clave descrita como el regulador maestro en el cáncer de mama. Por lo tanto, aquí, hipotetizamos que ACh altera la actividad de ERalpha a través de un mecanismo independiente de ligandos. Los resultados aquí revelan que la concentración fisiológica de ACh conduce a la liberación de Ca y a la actividad de las vías MAPK/ERK y PI3K/Akt. Estos cambios están asociados con una inducción de p-ERalpha y su reclutamiento al núcleo. Sin embargo, ACh no logra inducir la sobreexpresión de genes sensibles a estrógenos, lo que sugiere un mecanismo de activación diferente al de 17ß-estradiol. Finalmente, ACh promueve la viabilidad de líneas celulares de cáncer de mama de manera dependiente de ERalpha e induce la sobreexpresión de algunos marcadores de EMT. En resumen, nuestros resultados muestran que ACh promueve la proliferación celular del cáncer de mama y la actividad de ERalpha, posiblemente de manera independiente de ligandos, sugiriendo su papel putativo en la progresión del cáncer de mama.